Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

Содержание

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

ПЦР анализ, или полимеразная цепная реакция, — метод ДНК — диагностики, основанный на многократном увеличении молекул ДНК и РНК, характерных для того или иного патогенного микроорганизма. Для увеличения скорости копирования нуклеиновых кислот используются ДНК и РНК ферменты.

Днк — диагностика: пцр анализ, достоинства метода

ДНК — диагностика — это один из наиболее современных, высокотехнологичных методов исследования в лабораторной диагностике.

  • Полимеразная цепная реакция, или ПЦР анализ, позволяет выявить в организме человека многие инфекционные заболевания, которые были вызваны вирусами  или возбудителями бактериальной природы.
  • С помощью данного анализа можно обнаружить болезни не только в острой стадии, но и во время инкубационного (скрытого) периода.

Данный метод исследования обладает многими преимуществами:

  • Возможность обнаружить конкретного возбудителя и целого ряда микроорганизмов;
  • Высокая точность: вероятность ложных результатов ничтожно мала;
  • Диагностика скрытых, вяло текущих заболеваний, не беспокоящих какими-либо проявлениями;
  • Быстрое получение результатов;
  • Использование биологического материала различного рода: крови, плазмы, сыворотки крови, мочи, кала, биологических  жидкостей, мокроты, слизи, выделений;
  • ПЦР анализ может быть качественный и количественный, то есть, не только выявлять вид возбудителя болезни, но и давать информацию о его количественном содержании в организме.

Описание, анализ крови методом ПЦР 

Одним из самых распространенных видов исследования является анализ крови методом полимеразной цепной реакции, ПЦР;

  • Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.
  • В устоявшейся клинической практике ПЦР  анализы обычно сдают блоками, на определенные группы конкретных возбудителей. Например:

ПЦР — диагностика инфекций, передающихся половым путем, где одновременно выявляются:

ПЦР — диагностика бактериальных инфекций:

ПЦР — диагностика  вирусных инфекций,   ( вирусных гепатитов, герпеса и других ).

ПЦР — диагностика острых кишечных и респираторных инфекций.

Другие анализы методом ПЦР

Для данного анализа можно исследовать ряд других жидкостей организма: например, сок простаты, плевральную жидкость, спинномозговую, околоплодную, суставную, слюну и др..

  • Исследование практически не имеет отличий от анализа крови.
  • Происходит клонирование фрагментов нуклеиновых кислот различных возбудителей, методом полимеразной цепной реакции, ПЦР.
  •  На основе полученного результата специалисты делают вывод о наличии у человека какого-либо заболевания.

Полимеразная цепная реакция, анализ кала

Услышав жалобы на понос, рвоту, боли в животе, лечащий врач может направить клиента на сдачу ПЦР анализа кала.

  • На данный метод исследования затрачивается сравнительно небольшой промежуток времени.
  • Результаты пациент узнает уже через несколько часов.
  • Основными рекомендациями для получения достоверного результата является стерильность контейнера, в который будет помещен биологический материал,
  • а также исключение использования медикаментов, способных повлиять на работу кишечника или изменить окрашивание кала.

Проведение анализа мочи на ПЦР

  • Выявление инфекций, передающихся половым путем, чаще всего осуществляется посредством ПЦР исследования мочи.
  • Этот метод позволяет диагностировать, к примеру, вирус иммунодефицита человека, наличие в организме микроорганизмов рода Кандида.
  • Главным условием сдачи ПЦР анализа мочи является воздержание от половых контактов.
  • Женщинам также не следует сдавать мочу во время менструации.

Диагностика вирусных и бактериальных инфекций методом ПЦР

ПЦР диагностика позволяет выявить в организме наличие следующих инфекций:

  • Туберкулез;
  • вирус Эпштейна-Барра;
  • Токсоплазмоз;
  • Листериоз;
  • Опоясывающий лишай;
  • Цитомегаловирус;
  • Хламидиоз;
  • Клещевой энцефалит и многие другие;
  • При помощи ПЦР возможна диагностика вирусных гепатитов.
  • ВИЧ, вирус иммунодефицита человека, также может быть диагностирован посредством ПЦР теста.
  •  Данный метод обследования используется, например, для обнаружения ВИЧ у ребенка зараженной матери.

Высокая точность анализа ПЦР

Степень достоверности результата зачастую зависит от подготовки пациента.

  • Результат проведенного исследования всегда однозначен: либо отрицателен, либо положителен.
  • Но специалист не может поставить точный диагноз, руководствуясь только результатом теста ПЦР.
  • Он используется в качестве дополнительного обследования.
  • Для анализа крови методом ПЦР используется кровь, взятая из вены.
  • Причем, в случае, когда полимеразная цепная реакция проводится на ранних стадиях заболевания, есть вероятность ложноотрицательного результата.
  • Тогда необходимо повторное проведение процедуры через определенный период.

Пцр анализ на вич и вирус герпеса

  • Методом ПЦР можно определить наличие ВИЧ-инфекции в организме.
  • Наличие ВИЧ — инфекции  также является одним из условий, при которых необходима сдача ПЦР анализа на вирус герпеса.
  • Обследование поможет обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту за небольшой промежуток времени.
  • Для проведения исследования дополнительно может использоваться такой биологический материал, как мазок из уретры.
  • Перед процедурой отбора пациенту следует воздержаться от мочеиспускания в течение нескольких часов.

Диагностика туберкулеза методом ПЦР

Туберкулез также можно выявить по результатам анализа крови методом ПЦР.

  • Лечащие врачи дают пациентам направление на данное обследование для уточнения диагноза в спорных случаях.

Когда показан анализ ПЦР при беременности

  • ПЦР анализ как метод, используемый для диагностики огромного количества болезней, является обязательным для женщины во время беременности.
  • Обследование проводится для того, чтобы понять, имеет ли место угроза для нормального развития плода.
  • Обследование такого рода может быть назначено как в виде плановой процедуры, так и в случае, когда имеется подозрение на наличие каких-либо заболеваний.
  • Специалист может по результатам полимеразной цепной реакции сделать вывод о развитии определенных патологий в организме беременной женщины, а также о риске заражения плода.

Подготовка к проведению ПЦР анализа

Для максимально точного результата исследования клиент должен подготовиться процедуре отбора биологического материала. Среди рекомендаций по подготовке к сдаче крови выделяют:

  • Исключение тяжелых физических нагрузок;
  • Употребление «правильной» пищи (отсутствие в рационе алкоголя и жирной пищи).

Для продуктивной сдачи мочи необходимо:

  • Использовать стерильный контейнер для переноса жидкости;
  • Отбирать биологический материал утром, сразу после пробуждения;
  • Воздержаться от половых связей за несколько дней до процедуры.

Подготовка к отбору мазка включает в себя:

  • Гигиену половых органов с помощью обычной проточной воды, при отсутствии ароматных моющих средств;
  • Воздержание от мочеиспускания за некоторое время до сдачи биологического материала.

, полимеразная цепная реакция в картинках

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ Ссылка на основную публикацию

Источник: https://analyzekrovi.ru/pcr-tochnyj-i-bystryj-analiz-na-infekciyu/chto-takoe-polimeraznaya-cepnaya-reakciya-pcr-analiz

Полимеразная цепная реакция и ее применение в медицине

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

четверг, июля 18, 2013 – 07:59

Никогда ещё в истории медицины врачи не имели столь точного, быстрого и эффективного метода диагностики инфекционных заболеваний, как ПЦР или полимеразная цепная реакция. Широко внедрённый на сегодняшний день метод имеет ряд значительных преимуществ, позволяющих считать, что ПЦР – единственный метод, имеющий почти 100% точность.

ПЦР была изобретена в США. Автор этого открытия Кери Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию в области химии. Учёным давно был необходим метод, позволяющий получить неограниченное число копий исходной ДНК или РНК. ПЦР в течение нескольких лет использовалась как экспериментальный метод. Широкое внедрение ПЦР в клиническую практику началось в конце 80-х – начале 90-х годов.

Каким образом проводится анализ ПЦР?

В основе метода – увеличение количества определённых последовательностей искомой ДНК, характерной для того или иного возбудителя инфекции.

Наборы ПЦР реактивов, характерных для определённого возбудителя, загружаются в специальный аппарат. Туда же добавляют образцы, полученные от больного. Возможно проводить анализ с любыми образцами – такими, как кровь, слюна, мазок.

ПЦР отличается низкими требованиями к чистоте образцов. Можно исследовать даже кал.

На ПЦР аппарате запускается циклический процесс нагревания и охлаждения смеси реактивов и образцов. В ходе циклов, если в смеси находится последовательность ДНК, характерная для какого-либо инфекционного агента, происходит многократное увеличение копий ДНК или РНК возбудителя.

Когда количество копий ДНК или РНК возбудителя достигает количества, достаточного для обнаружения, можно провести качественный или количественный анализ. Наличие искомой ДНК свидетельствует о положительном результате – обнаружена последовательность нуклеотидов, характерная для возбудителя инфекции или для наследственной патологии.

Количественный ПЦР анализ позволяет определить, как много вирусов содержится в образцах. Таким образом, определяется тяжесть вирусной инфекции, называемая вирусной нагрузкой.

В тех случаях, если ПЦР отрицательный – можно с уверенностью сказать, что искомой патологии у человека нет.

Лаборатория ПЦР диагностики представляет собой сложный комплекс оборудования и реактивов. По этой причине анализ достаточно дорог.

Так как метод определяет последовательности ДНК, ПЦР широко используется и для других целей: в криминалистике, для установления факта отцовства, в молекулярной биологии и химии для проведения экспериментов.

Почему ПЦР – лучший из доступных сегодня методов диагностики

Плюсы ПЦР диагностики:

1. Широта диагностических возможностей – с помощью ПЦР можно определять все виды вирусных, бактериальных и грибковых инфекций.

2. Доступность – сегодня ПЦР проводится в любой частной или государственной клинике.

3. ПЦР может использовать для анализа любые образцы тканей или биологических жидкостей.

4. ПЦР – очень точный метод. Другой метод, применяющийся для диагностики инфекции, называемый иммуноферментный анализ или ИФА, в 30-40% случаев, по данным различных исследований, не обнаруживает возбудителя.

5. ПЦР определяет самого возбудителя, в отличие от серологических методов. (Серологические методы основаны на определении антигенов или антител к возбудителю в сыворотке крови.

Для этого инфекция должна какое-то время существовать в организме больного. Например, первые месяцы после заражения ВИЧ, серологические методы не дают положительных результатов, несмотря на то, что болезнь уже началась.

Этот период называют серонегативным окном. ПЦР лишена этого недостатка).

6. ПЦР – высокоспецифичный метод. У него нет таких недостатков, как ложно-положительные или ложно-отрицательные результаты. Ошибки метода полимеразной цепной реакции скорее зависят от человеческого фактора.

Как выглядят результаты ПЦР

Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определённых в ходе анализа. Во второй результаты. Например:

ВозбудительРезультат
HCV (ПЦР)отр.
Микоплазма (ПЦР)отр.
ВИЧ (ПЦР)отр.
Хламидия (ПЦР)отр.

В списке может быть много инфекций. В скобках указывается, что анализ был проведён с помощью полимеразной цепной реакции. Таблица упрощена, так как одних микоплазм существует несколько разных видов.

В спорных случаях, возникающих при положительных результатах на такие страшные диагнозы, как ВИЧ, полученные другими методами, ПЦР выступает в роли решающего метода, подтверждающего или исключающего диагноз.

Источник: http://www.probirka.org/biblio/polezno/5187-polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya-i-ee-primenenie-v-meditsine.html

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) диагностика: что это такое

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

В современном мире существует множество способов обнаружить возбудителей заболеваний на разных этапах развития заболевания.

Одним из таких методов является PCR (метод ПЦР или полимеразная цепная реакция), позволяющий выявить инфекцию на самом раннем этапе.

Буквально одна единица ДНК или РНК уже могут указать на наличие того или иного возбудителя в организме при должном уровне подготовки пациента и профессионализма лаборантов медицинского учреждения.

ПРЦ-исследование, что это такое?

Анализ на ПЦР заключается в копировании ДНК и РНК возбудителя в лабораторных условиях. Так как основным хранилищем генетической информации является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), образованная 2 нитями, соединенными нуклеотидами, именно при множественном копировании (синтезе) этой кислоты можно установить наличие патогенного организма, если речь идет о бактерии.

Бактерии имеют свою собственную оболочку, защищающую их от внешней среды, которая нередко является агрессивной по отношению к последним. У вирусов же нет собственной оболочки (у некоторых представителей имеется нечто похожее на оболочку), а информацию в себе несет не ДНК, а РНК (рибонуклеиновые кислоты).

РНК устроены таким образом, что они встраиваются в цепи ДНК организма-переносчика и меняют их, позволяя проникать в клетки и жить за счет организма.

Грубо говоря, бактерии и вирусы оставляют «отпечатки» своими ДНК и РНК, которые и выявляет анализ ПЦР. Эти «отпечатки», как и отпечатки пальцев, являются уникальными для каждого возбудителя.

Поэтому ПЦР позволяет выявить заболевание на любых этапах, даже если развитие патогена происходит бессимптомно.

До широкого внедрения ПЦР в гинекологии и урологии на ИППП широко использовались методы:

  • микроскопия — окрашенные и неокрашенные препараты исследуются через микроскоп. Метод очень завязан на опытности лаборанта. Таким методом хорошо выявляются бактерии, имеющие большой размер (гарднереллы, кандиды, трихомонады, гонококки);
  • бактериология — метод заключается в выращивании возбудителей инфекции на питательном агаре, идентификации возбудителя и определения чувствительности его к антибиотикам. Долгое время считался «золотым стандартом». К минусам относят необходимость быстрой доставке материала в КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория), сроки выращивания и выяснения чувствительности к группам антибактериальных препаратов (как правило, 5-7 суток);
  • иммуноферментный анализ — Определение антител организма, возникающих в ответ на внедрение антигена возбудителем инфекции. Из плюсов стоит отметить возможность определения стадии заболевания (острая стадия сопровождается наличием IgG в сыворотке крови, хроническая – IgM.) К минусам относится невозможность определения у людей с ослабленным иммунитетом, а также специфичность ИФА. Другими словами, при наличии только результата иммуноферментного анализа, невозможно было выставить диагноз, а можно было только определить, что организм борется с какой-либо инфекцией.

Как происходит сдача анализов на ПЦР

В зависимости от материала, который забирается для проведения анализа ПЦР, существует несколько обязательных правил для пациента. Кровь сдается строго натощак утром.

Мочу тоже стоит сдавать утром, первую порцию. Мокрота также сдается натощак, хотя это и необязательно. Мазки сдаются в любое время суток и имеют специфические требования.

Мазок из ротоглотки также следует сдавать утром до приема пищи.

Забор материала производится сертифицированным специалистом стерильными одноразовыми инструментами. Берут анализ крови на ПЦР одноразовым стерильным шприцом, из вены забирают приблизительно 1-2 мл венозной крови для выявления таких инфекций как герпес или ВПЧ (вирус папилломы человека). Мочи достаточно 10 мл, мокроты – субстанции, размером со спичечную головку.

Для каждого вида анализа ПЦР существуют свои требования:

  • кровь, как говорилось выше, забирают из вены натощак;
  • мочу следует сдавать утром, первую порцию. Но, если забор является срочным, то достаточно сдать мочу по прошествии 2 часов после последнего мочеиспускания. Это позволит инфекции набрать необходимую критическую массу на 1 мл для более простого обнаружения патогена;
  • как берут соскоб из уретры. Первым делом обрабатывают раствором NaCl 0.9% наружное отверстие уретры. Затем, совершая циркулярные движения, зонд проводят на 2-4 см в уретру. Головку зонда, которая имеет щетинистое строение отсекают и кладут в пробирку со специальным раствором (своеобразный питательный агар для бактерий);
  • из влагалища производят мазок. Предварительно убирают секрет бартолиновых желез, затем из заднего нижнего свода влагалища специальной ватной палочкой происходит забор материала. При видимых патологических изменениях во влагалище мазок следует брать непосредственно на поврежденном участке;
  • как проводят соскоб из цервикального канала у женщин. Удалив слизь из наружных половых путей, зонд на 0,5 – 1,5 см вводят в шейку матки, совершают циркулярное движение и, не касаясь стенок влагалища, удаляют зонд из половых путей. Затем совершают действия, аналогичные соскобу из уретры;
  • из ротоглотки забор происходит натощак. Придерживая кончик языка, зондом производят мазок с задней стенки глотки, по миндалинам или по небным дужкам. Не соприкасаясь со слизистой ротовой полости и зубами, зонд выводится и отправляется на пцр-исследование;
  • из конъюнктивы, предварительно очистив физиологическим раствором гнойные выделения, производят соскоб слизистой нижнего века от латерального к медиальному краю. Веко при этом придерживается медицинским работником во избежание соприкосновения зонда со слизистой глаза и ресницами.

Подготовка к исследованию

Анализ на ПЦР является самым быстрым и достоверным способом на ранних этапах обнаружить инфекцию, но бывают и ложноположительные/ложноотрицательные результаты.

Для сохранения нервной системы как своей, так и сотрудников медицинского учреждения, следует правильно подготовиться к исследованию.

Подготовка к ПЦР у мужчин

Перед исследованием ПЦР мужчинам следует помнить, чего делать нельзя:

  • мочиться за 3 часа до исследования;
  • производить спринцевание и стерильную обработку члена;
  • мыть член мылом, содержащим антибиотик;
  • заниматься сексом за двое суток до ПЦР на ИППП;

Источник: https://tvojajbolit.ru/issledovaniya/polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya-ptsr-diagnostika-chto-eto-takoe/

Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.

Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.

Полимераза

Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу.

 Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие.

 Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus.

 Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC.

 Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.

Шаблон ДНК

Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК.

 Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР.

 Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.

Праймеры

Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР.

 Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований.

 Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров.

 Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.

Нуклеотиды

Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP.

 Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP.

 Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.

Буфер

Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным  буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.

Термоциклирование

Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют.

 При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом.

Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:

На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую ​​полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.

  1. Денатурация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.

  1. Отжиг (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК.

 Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров.

 Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.

  1. Удлинение или элонгация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´.

 Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции.

 Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования.

 Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.

Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз

Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.

Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации.

Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент.

 Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.

Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи.

 Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения.

Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.

Удачи и счастливого ПЦР!

Источник: https://LabwareGuid.ru/2019/02/05/pcr-user-guide/

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение.

  Наверное, каждый врач сталкивался в своей практике с такими случаями — никакой явновыраженной сиптоматики, микробиологические исследования — в пределах нормы, а у пациента температура две недели не падает, или простатит рецидивирующий, или еще какая-то болячка, с которой не удается справиться. А истинную причину выяснить ну никак не удается. Мистика? Непрофессионализм? Нет. Это недостатки диагностики. Иногда вирус или бактерия могут находиться в крови столь малых количествах, что чувствительность традиционных методов диагностики не позволяет их выявить.

  А они, тем временем, делают свое темное дело, нанося порою непоправимый вред организму. Но ситуация меняется. теперь на вооружении у врачей есть тонкий высокочувствительный метод диагностики — полимеразная цепная реакция (ПЦР).

  В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний.

  Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет получить значительное увеличение количества определенных участков ДНК из биологических проб, в которых исходная ДНК содержится в сверхмалых количествах.

  Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами – расщепление или сращивание участков ДНК, введение мутаций. Поэтому метод ПЦР нашел свое практическое применение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, определении отцовства , в клонировании и в генной инженерии.

  Первые опыты по амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, названных праймерами, проводил еще норвежский ученый Хьеллю Клеппе в 70-е годы прошлого столетия. Но его идея так и осталась нереализованной.

И только спустя почти десять лет, в 1983 году полимеразная цепная реакция была открыта американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы.

Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. А через восемь лет К.Муллис получил Нобелевскую премию за открытый им метод.

Что такое пцр

  Каждый живой организм имеет определенный набор специфичных, присущих только ему участков ДНК. Метод ПЦР позволяет найти в исследуемом материале среди огромного количества генетической информации именно такие специфичные участки и многократно их размножить.

  Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК начинается только в определенных местах, где расположены стартовые блоки, а не в любой произвольной точке.

Суть метода заключается в том, что маркировав стартовыми блоками специфичные участки ДНК, характерные только для данного вида, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок ДНК. В результате нарабатывается достаточное количество генетического материала для последующей детекции.

Метод ПЦР настолько точен, что он позволяет не только выявлять наличие ДНК возбудителя в биологической пробе, но и точно установить его количество и генотипическую принадлежность.

Как работает пцр

  В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований.

Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований.

Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

  Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

  Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

  Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры.

При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными.

Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

  После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий.

Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий.

А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Компоненты реакции пцр

  Проведение анализа исследуемого материала методом ПЦР состоит из 3 этапов:

  • Подготовка материала для ПЦР путем разделения и изоляции ДНК и РНК
  • Собственно проведение полимеразной цепной реакции
  • Детекция продукта ПЦР

  Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

  Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий – Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

  Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Может быть использовано высококипящее минеральное масло (например, вазелиновое). Но это зависит от амплификатора, в котором проводится реакция. Если это амплификатор с подогреваемой крышкой, исключающий испарение реакционного раствора, то масло в пробирку не добавляется.

  Также необязательным компонентом является пирофосфатаза. Этот фермент катализирует гидролиз побочного продукта реакции – пирофосфата, который может ингибировать полимеразную цепную реакцию.

Применение пцр

  ПЦР – диагностика универсальна. Для проведения анализа методом ПЦР используется любой биологический материал, в котором может содержаться ДНК возбудителя – слизи, моча, кровь, мокрота, соскобы и биоптаты.

  широкое распространение получил метод ПЦР для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических. Это такие инфекции как хламидиоз, гарднереллез, микоплазменная инфекция и пр. Это возбудители, которых сложно выявить классическим способом выращивания клеток в лабораторных условиях. Да и анализ антител в серологическом растворе может быть неточным.

  А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты или мочу, можно с точностью установить наличие именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.

  Также метод ПЦР незаменим для диагностики вирусных заболеваний. Кроме выявления наличия вируса в пробе, ПЦР позволяет определять генотип вируса. Что очень важно, например, при выборе методов лечения папилломавируса человека и прогнозирования развития заболевания, т.к.

вирусы ВПЧ, принадлежащие к разным типам, обладают различной патогенностью и онкогенностю. Также генотипирование важно при диагностике вирусных гепатитов. Метод ПЦР используется для контроля за эффективностью лечения при вирусных гепатитах.

Для этого производится так называемый «количественный» анализ, который позволяет не только выявить наличие вирусной ДНК, но и с точностью определить количество вирусов, содержащихся в крови.

  Не стоит забывать и о диагностике ВИЧ-инфекции.

  Метод ПЦР нашел свое применение в пульмонологии, где он используется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии.

  Метод может быть применен для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

  Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам – это только одна из возможностей ПЦРдиагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое.

  Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему детской смертности и инвалидности, связанной с развитием у детей наследственных болезней, наследственной предрасположенности к некоторым видам смертельных недугов (например, к раку). Именно ПЦР является тем методом, который позволяет выявить поврежденные участки ДНК, связанные с точечными мутациями генов, и влекущие страшные последствия.

  Несмотря на то, что ПЦРдиагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования и соблюдением ряда правил.

ПРЕИМУЩЕСТВА

  Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.

  Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.

  Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.

  Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.

  Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов.

В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней.

Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

  Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.

  Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.

  Специфичность метода составляет 100%.

  Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.

  Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.

С начала нового века в медицинской практике все большее применение находит метод исследования ПЦР (полимеразная цепная реакция), характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью

Подробнее…

doclvs.ru

Остались вопросы?
Нужен совет врача?
Врачи всех специальностей ответят на беспокоящие Вас вопросы! бесплатно!

Внимание! информация на сайте не является медицинским диагнозом, или руководством к действию и предназначена только для ознакомления.

Источник: http://doclvs.ru/medpop8/pcr2.php

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.